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上海金鹏分析仪器有限公司销售部

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使用Blupadstart蛋白纯化系统过程中常遇见一些问题,这里整理了以下几个蛋白纯化实验中遇见的问题及其解决方案。
        1)我现在手头有个融合蛋白,纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析,之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。
请问有哪些可能会出现这种原因?怎么解决?测过基因序列,没有问题。细胞破碎后,融合蛋白在沉淀里,我用助溶剂提取后,可以用GST做亲和层析,但效率只有50%~60%左右。洗脱完融合蛋白不需要助溶剂,但这样的条件下切割完后目的蛋白会沉淀,我用0.5%CHAPS助溶可勉强溶解部分,目的蛋白疏水性比较强。
       既然是疏水性很强你可以加点甘油或者乙二醇降低极性,这样溶解就会好得多,此外你也直接加2%的PEG这样也降低极性,同时保护你的蛋白,你再做纯化就可以了,我以前遇到这样的蛋白是用10%的乙醇加3-5%的PEG-5000,这样的情况下蛋白还是活性回收率很高,我觉得那些表面活性剂能不用还是不用的好,你失去活性你可以监测一下提取,纯化,酶切到底哪里失去了活性,这样更容易解决你的问题。还有注意缓冲液PH值,看看改变它对溶解度有没有影响。蛋白有沉淀那你可以稍微把蛋白的浓度降低点,这也是个办法。
        2)请问有没有合成过配体为FMN的亲和胶?
        亲和的填料合成过20来种,你是希望用它来纯化某种脱氢酶吗,我看FMN可偶联的有限,倒是FAD有活泼的好偶联,何况它们几乎是同一个辅酶,你是不是考虑把FAD连上去。当然FMN的结构上也有个仲胺,可以偶联到带长手臂的环氧活化的填料上,而溴化氰活化或别的活化的介质都不大好,因此我觉得这个没有什么问题。   
       此外如果是以FMN为辅酶的,那我还可以建议你试试蓝色琼脂糖凝胶,因为它的配基的结构和FMN的三个环很相似,它能纯化不少脱氢酶和激酶。
相应的偶联的材料,要自己合成亲和填料,有很多公司都提供活化好的介质,自己偶联就可以,其中比较常用的有启维益成公司的溴化氰琼脂糖凝胶,环氧琼脂糖凝胶,琼脂糖凝胶,羧基琼脂糖凝胶,活化酯琼脂糖凝胶,以及巯基琼脂糖凝胶等,但是如果是小分子的配基选择有3-10碳作为手臂的活化介质为好,此外也曾经有文献报导固定辅酶时,偶联位置不同,选择性有差别,因此你可以选择自己适合的活化介质。
       不同的活化的介质对偶联的配基有不同的要求,所以要先对自己的配基有一个清楚的了解就可以选择合适的活化介质。
       我一般在合成的时候大多选择环氧琼脂糖凝胶,它能应用的范围广巯基基都可以,而且合成的介质刚性好,非特异吸附少,所以不需要特殊处理未反应基团。此外键合的键很稳定,配基脱落少。我觉得是不错的选择。
       包涵体的蛋白复性做得不多,但是我记得有个哥们说最管用的办法也是最简单的方法,他说在复性的时候尽量别想什么太高难的技术,那些时髦但不一定好用,常用的有透析复性,稀释复性,包括国外的专家也这么说。我觉得有时候开始摸不出来未必就是方法不行,关键要经常改变条件。
层析复性很时髦,但是真正能用的不是很多,我觉得蛋白这东西难就在于大多都不相同,所以关键要多看文献,多琢磨自己蛋白的特性,多尝试。

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上海金鹏分析仪器有限公司,成立于2007年5月,是一家专注于生命科学和分析化学领域的新型企业。凭借雄厚的技术与研发实力,公司已拥有国家砖利、著作权等二十多项,产品通过欧盟CE认证、ISO9001:2008质量体系认证。

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